葉綠素的熒光光譜測量

實(shí)驗背景：「葉綠素」的光學(xué)知識

       葉綠素是植物從光中吸收能量所需的基本色素。它在可見(jiàn)光譜的藍色和紅色部分吸收光較強，在可見(jiàn)光譜的綠色部分吸收光較弱，這使它在人的肉眼中成為可識別的綠色。

       葉綠素的檢測可以追溯到19世紀早期，1817年Joseph Caventou和Pierre Pelletier將其分離出來(lái)。后來(lái)，利用了立體化學(xué)、核磁共振、光學(xué)和質(zhì)譜等方法檢測了分子的元素組成和一般結構。

要確定葉綠素濃度，其中一種方法就是測量其熒光發(fā)射率。葉綠素在650-800 nm范圍內可以檢測到熒光，再通過(guò)測量700 nm和735 nm左右波長(cháng)的熒光發(fā)射峰值，計算它們的比值，可以推導出葉綠素含量的線(xiàn)性關(guān)系。

葉綠素的存在是植物呈現綠色的原因，而缺乏葉綠素會(huì )導致葉子的顏色變成紅色或黃色?；谶@一點(diǎn)，我們使熒光發(fā)射峰值更高，從而得到葉綠素濃度更高的綠色一品紅葉。

本實(shí)驗將過(guò)比較不同顏色一品紅(紅、綠、白)葉片的熒光光譜，測定其葉綠素濃度。

圖1 用于實(shí)驗的一品紅植物

溶解在甲醇中的紅色葉片樣本(左)，綠色葉片樣本(中)和白色葉片樣本(右) 

此外，我們還將測量一個(gè)白色一品紅片樣本，對比其與紅色和綠色葉子樣本的葉綠素濃度。測量時(shí)，每一片葉子都被溶解在甲醇中，以便從每個(gè)樣品中分離并提取葉綠素(圖1)。

實(shí)驗系統：

本實(shí)驗的系統如圖所示(圖2)。光譜儀使用的是AvaSpec-ULS2048CL-EVO，該設備擁有新的光譜學(xué)技術(shù)。這款光譜儀提供USB3.0通信，速度是USB2.0的10倍，使用了CMOS探測器，AS-7010電路板，這款電路板上可以存儲更多的光譜，實(shí)現更多功能。此外，這款光譜儀可以定制狹縫尺寸，光柵，光纖入口和連接器，以滿(mǎn)足各類(lèi)應用需求。

圖2：葉綠素測量實(shí)驗裝置

其他用于實(shí)驗的配件有單色儀, 用于過(guò)濾特定波長(cháng)光源,以確保只有所需觀(guān)察的發(fā)射光譜。比色皿支架(CUV-DA)，可以使樣品暴露在較大的光量下。一個(gè)比色皿遮罩 (CUV-COVER-DA)，用來(lái)減少環(huán)境光的影響。600微米纖芯光纖(FC-UVIR600-1-BX)，用來(lái)連接光譜儀和比色皿。三個(gè)樣品(紅葉樣品、綠葉樣品和白葉樣品)都放入比色皿中測量。

實(shí)驗方法及數據：

每個(gè)葉片樣本溶解在約30ml的甲醇中，將存有樣本的溶液在120°C的加熱板上加熱1分鐘來(lái)提取葉綠素，再將混合溶液移入比色皿中進(jìn)行分析測量。將單色儀直連到AvaLight-Hal-S-Mini上，接著(zhù)在不同波長(cháng)之間循環(huán)測試，直到找到能使樣品達到亮度較大的波長(cháng)，此激發(fā)波長(cháng)為620 nm處。

數據分析模塊，我們使用了AvaSoft的Sd模式，AvaSoft是我們定制的軟件包。Sd模式是測量熒光的常用模式。因為Sd模式從每個(gè)波長(cháng)的原始計數(即范圍模式)中減去暗背景光譜(光譜儀在沒(méi)有光源的情況下測量的光譜)。這有助于減少光譜中的噪聲，并更好地隔離發(fā)射峰。

調整積分時(shí)間可以增加或減少一次測量的光量，這會(huì )影響結果光譜的整體幅度大小。平均次數表明兩個(gè)值被平均在一起，可以提供更一致的光譜結果。實(shí)驗時(shí)，我們將積分時(shí)間設為9秒，平均值設為2。此外，我們用試管支架蓋覆蓋了所有樣品，以確保測量的光來(lái)自光源，避免環(huán)境光的影響。

實(shí)驗結果分析：

圖3：紅色一品紅樣品的熒光光譜

發(fā)射峰在673.90 nm和722.84 nm

圖4：綠色一品紅樣品的熒光光譜

發(fā)射峰在687.17 nm和730.87 nm

圖5：白色一品紅樣品的熒光光譜

發(fā)射峰在675.63 nm和726.28 nm

紅色一品紅葉片樣品的熒光光譜測量到的發(fā)射峰在673.90 nm和722.84 nm(圖3)。這符合與文獻報道中所描述的的：葉綠素發(fā)射峰在650-800 nm之間。

綠色一品紅葉片樣品的熒光光譜在687.17 nm和730.87 nm處顯示更高的發(fā)射峰(圖4)。與紅色葉片樣品相比，這兩個(gè)峰略高，但仍與文獻報道所描述的葉綠素發(fā)射峰一致。

白色一品紅葉片樣品的熒光光譜(圖5)與紅色葉片樣品具有相似的發(fā)射峰(675.63 nm和726.28 nm)，但每個(gè)發(fā)射峰的強度更大。

圖6：三種樣品的熒光光譜對比圖

紅色一品紅樣品(紅色線(xiàn))，綠色一品紅樣品(綠色線(xiàn))，白色一品紅樣品(藍色線(xiàn))

圖6為紅色一品紅樣品(紅色線(xiàn))、綠色一品紅樣品(綠色線(xiàn))和白色一品紅樣品(藍色線(xiàn))的熒光光譜比較。為了直接比較每個(gè)樣品的葉綠素含量，計算735 nm和700nm峰值的比。紅葉樣本，兩個(gè)峰的比值為7492.67/26998.33，等于0.278。對于綠葉樣本，比值為44973.55/53473.00，即0.841。白葉樣本的比值為13650.20/44659.54，即0.306。

綜上所述，紅葉和白葉樣品相比，綠葉樣品中的葉綠素濃度要高得多。此外，紅葉和白葉樣本的葉綠素濃度相似，盡管白葉樣本比紅葉樣本看起來(lái)更綠。

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